proteina纯化原理，his纯化试剂盒

HRV-3C 蛋白酶概述

PreScission 蛋白酶是一种在大肠杆菌中重组表达的带有GST 标签的人鼻病毒(HRV) 14 型3C 蛋白酶，也称为HRV 3C 蛋白酶或HRV3C 蛋白酶，对八肽序列Leu-Glu-Val- 具有特异性识别。 Leu-Phe-Gln-Gly-Pro 或核心五肽序列Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，以及Gln 和Gly 氨基酸残基之间酶消化通常用于去除谷胱甘肽S-蛋白酶其中常用的蛋白酶有：转移酶(GST)、His 或融合蛋白上的其他标签。

HRV-3C蛋白酶主要供应商产品介绍

His标签型HRV-3C蛋白酶（图片取自义翘神州产品说明书）

GST 标签类型HRV-3C 蛋白酶（照片取自Arco Biosystems 产品手册）

HRV 3C 蛋白酶对对照蛋白裂解的SDS-PAGE 分析。

将1 mg/ml 66 kD GST 融合蛋白(1) 与HRV 3C 蛋白酶以1: 比100 (w/w) 的比例在裂解缓冲液中在4C 下反应4 小时(2) 和3 天(3)我做到了。 ）。裂解产物为40 kD 和26 kD。

HRV-3C蛋白酶反应条件：

10x 反应缓冲液：

500 mM Tris-HCl (pH 7.0)

1.5M氯化钠

10mM 乙二胺四乙酸

10mM 滴涕

常用亲和色谱洗脱缓冲液的活性

常用亲和层析洗脱缓冲液的成分

盐或添加剂的活性

不同温度下的活性

初始反应速率的温度依赖性。

MBP-NusG 融合蛋白底物

在指定温度下由TEV [A] 或R3C [B] 蛋白酶消化。在相应的插图（右）中，显示了未切割（泳道1）和裂解（分别为泳道2-10、2、5、10、20、30、40、50、60）的代表性SDS-PAGE 凝胶。到过。分钟）底物在4C。

3C 酶和肽底物的TEV 处理动力学参数

HRV-3C 蛋白序列

氨基酸序列

NP_740524(182aa)GPNTEFALLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPHAQPGDDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ

NT*-HRV-3C蛋白酶

MHHHHHHSHTTPWTNPGLAENFMNSFMQGLSSMPGFTASQLDKMSTIAQSMVQSIQSLAAQGRTSPNDLQALNMAFASSMAEIAASEEGGGSLSTKTSSIASAMSNAFLQTTGVVNQPFINEITQLVSMFAQAGMNDVSAGNSGGGGSGPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKY KLVDPENIN L ELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ*

HRV-3C的表达

在1995 年（G.M. Birch，1995）和2011 年范德比尔特大学结构生物学中心（作者未注明）方案中，HRV-3C 酶的His 标记版本被称为包涵体表达。然而，我们的pET28a-HRV-3C质粒（表达His标签的3C酶）可以在常规LB培养基中实现可溶性表达（个人数据，未发表）。

在Leong（1992、1994、1999）的一系列论文中，GST-3C 蛋白酶以可溶形式表达，并使用两步GST 亲和填料和分子筛进行纯化。 GST 标签融合可以促进3C 蛋白酶的可溶性表达，产量为22 mg/L (Antoniou, 2023)。 3C 蛋白酶的DsbA 和MBP 融合版本也已成功制备，但产量未见报道。

Abdelkader 报道，使用蜘蛛丝蛋白NT* 融合表达可以实现超过300 mg/L 的表达水平(Abdelkader, 2023)。

Lee 等人(Lee, 2023) 报道了一种快速表达和纯化N 末端有7 个Lys、C 末端有6 个His 标签的3C 蛋白酶的方法。该程序使用MBP融合表达，整个Ni亲和和纯化过程需要8小时才能完成。

纯化的HRV3 蛋白酶蛋白构建体的示意图和氨基酸序列。

SDS-PAGE 结果：7Lys-MBP-HRV3C-6 的完整纯化过程。

Catascis Biotech 销售的HRV-3C 质粒的信息

HRV-3C 质粒和酶产品

参考：

1. G. Antoniou 等人使用： 酶的统计设计实验来优化重组人鼻病毒14 型3C 蛋白酶的可溶性表达和纯化。分子生物技术，2023 年8 月11 日

2. L. Leong 等人，普通感冒病毒、人鼻病毒14 型蛋白酶的高效表达和纯化。水晶生长杂志，1992(122):246-252

3. P. Walker 等人使用重组融合蛋白酶高效快速地亲和纯化蛋白质。自然生物技术，1994(12):601-605

4. L. Leong。重组融合蛋白酶在重组蛋白亲和纯化中的应用，1999(12):269。

5. C.W. Lee 等人使用聚组氨酸和聚赖氨酸标签快速纯化HRV3C 和TEV 蛋白酶。生物设计， 2023(8):49-53

6. E. Abdelkader, G. Otting。 NT HRV3CP: 人鼻病毒14 3C 蛋白酶的优化构建体，用于高产量表达和快速亲和标签切割。生物技术杂志https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2023.11.005。

7. R. Ullah 等人，在不同缓冲液、添加剂和洗涤剂溶液中研究用于重组蛋白生产的人鼻病毒3C 蛋白酶的活性。公共公共图书馆一号，2023 年4 月19 日

8. S. Raran-Kurussi 等人，烟草蚀纹病毒和鼻病毒3C 蛋白酶的温度依赖性，Anal Biochem，2013 年5 月15 日。